Un des plus grands défis scientifiques qui se présente à nous est le développement de technologies vertes dont le but est de diminuer nos besoins en combustibles fossiles, réduisant potentiellement un réchauffement climatique global. Pour aborder ces problèmes, j'ai développé un projet de recherche qui a deux buts principaux: (i) la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquelles les microbes influencent le recyclage du carbone environnemental, (ii) la manipulation génétique de ces microbes pour élaborer des stratégies de bioénergie et bioremédiation. Utilisant le savoir et l'expertise que j'ai accumulé pendant ma formation, j'établis un programme de recherche interdisciplinaire, à l'interface de la biologie des systèmes, de la microbiologie, de la génétique, et de la biochimie. Plus spécifiquement, je développerai trois axes principaux de recherche dont les buts sont:
La biomasse cellulosique est la source la plus abondante d'énergie biologique du monde (Leschine 1995), mais elle se compose d'une matrice de polysaccharides qui est très difficile à dégrader pour les microbes. Clostridium phytofermentans est un anaérobe mésophilique qui pousse sur les deux composants principaux de la biomasse cellulosique, la cellulose et l'hémicellulose. Ce microbe sécrète des enzymes capables d'hydroliser cette matrice de polysaccharides et ensuite fermente les sucres résultant de la dégradation en éthanol et hydrogène. Le génome de C. phytofermentans contient 161 gènes codant les enzymes pour hydroliser des polysaccharides, ce qui suggère une grande diversité des enzymes est nécessaire pour dégrader la biomasse cellulosique.
Pour développer une compréhension systématique de la façon dont C. phytofermentans fermente la biomasse, nous avons employé une stratégie (Fig 1) qui intègre la spectrométrie des masse pour quantifier le protéome (2500 protéines ont ansi été analysées) avec des analyses de croissance, de fermentation, et de microscopie électronique (Tolonen et al, 2010). Nous avons pu quantifier les combinaisons d'enzymes extra- et intra-cellulaires nécessaires à la dégradation de la cellulose et la hemicellulose, ainsi que les enzymes glycolytiques et fermentatives permettant de produire avec un rendement quasi maximal de l'éthanol et l' hydrogène. Nous avons aussi découvert que, lorsque les cellules sont transférées du glucose au cellulose, elles changent l'expression des gènes liés à divers processus cellulaires. Par exemple, les cellules augmentent l'expression des protéines nécessaires à la synthèse du tryptophane et diminuent celles nécessaires à la synthèse des acides gras et à la motilité des bactéries. Enfin, nous avons intégré ces données dans un modèle qui décrit toutes les enzymes principales pour la conversion de biomasse en éthanol et hydrogène.
Fig 1 Strategie pour étudier et optimiser la fermentation cellulosique. Cultures des sources de biomasse différentes sont évalués pour A la croissance et consommation de biomasse, B les produits de fermentation, C adhérence cellulaire au substat cellulosique, et D la quantification des proteines par la spectrométrie des masses. E Les résultats sont integré pour identifier les maniéres d'optimiser le milieu et les souches pour la conversion de biomasse. L'image est de Tolonen et al, 2010.
Nous avons récemment établi des méthodes pour manipuler l'expression des gènes chez C. phytofermentans. Plus particulièrement, nous utilisons E. coli pour le transfert conjugal d'un plasmide qui contient un intron de groupe II (Fig 2A) qui peut être modifié pour s'insérer de manière ciblée n'importe où dans le génome (Fig 2B). Dans une première étude, nous avons inactivé le gène cphy3367 qui code pour une hydrolase qui est fortement exprimé lors de l'utilisation de la cellulose (Tolonen et al, 2009). La souche mutante obtenue (AT02-1) pousse comme la souche sauvage sur un certain nombre des sources de carbone, mais elle a complètement perdu la capacité de dégrader la cellulose (Fig 2C). Bien que C. phytofermentans exprime des nombreuses enzymes cellulolytiques en présence de cellulose, une seule enzyme apparaît donc essentielle pour ce processus. Cette découverte était le sujet d'un commentaire récent (Wilson, 2009). Actuellement, nous utilisons les résultats de notre étude protéomique pour identifier d'autres candidats à étudier par cette approche génétique. De plus, pour identifier d'autres mutations inattendues qui affecteraient la fermentation de biomasse, nous développons des méthodes d'analyses à haut débit pour cribler des banques de mutants par transposition.
Fig 2 A Plasmide pour l'inactivation des gènes chez C. phytofermentans avec un intron de groupe II. B L'intron peut être adapté pour s'insérer de manière ciblée n'importe où dans le génome avec un PCR de deux étapes. C L'inactivation du gène cphy3367 dans la souche AT02-1 élimine la capacité de dégrader la cellulose. Les images sont de Tolonen et al, 2009.